安捷伦Seahorse数据归一化解决方案

Seahorse数据归一化的重要性

    功能生物数据的归一化是原始数据展示和后续分析工作流程中的关键因素，以确保对结果的准确一致的解析。安捷伦 Seahorse XF 分析仪能够实时同步测定活细胞中的两种主要细胞能量代谢途径，即线粒体呼吸和糖酵解。XF 代谢分析在这方面也是如此，大多数实验需要进行某种形式的归一化。无论是比较不同的细胞类型、基因修饰还是化合物处理，都必须根据共同的参数将数据归一化以便正确比较。XF 分析可在包括细胞数、基因组 DNA 和总细胞蛋白质的多个参数层面进行归一化，使用细胞数来归一化是大多数XF应用中使用最广泛、最稳定的方法。

 

一、贴壁细胞的归一化方法

通过计数 Cytation 1/5 采集的图像中的荧光标记细胞核来测量每孔细胞数，此方法集成了XF 技术与 Cytation 1/5 细胞成像多模式酶标仪。

XF 成像和归一化系统的典型工作流程如下：

Agilent BioTek Cytation 1/5 成像仪拥有 1.25 倍到 60 倍的荧光和高对比度明场 成像功能，能够对细胞进行自动化数字 显微成像，操作十分简单。但是，XF 成像和归一化解决方案适用于单层生长的单核贴壁细胞系，不适用于悬浮生长的细胞或原代免疫细胞，因为它们的细胞核尺寸很小，不能提供足够的背景对比度来准确计数。一般来说，造血来源的细胞不能有效地吸收Hoechst染料。

二、T细胞等悬浮细胞的归一化方法

NovoCyte流式细胞仪闪亮登场，NovoCyte具有绝对计数的能力。

NovoCyte流式细胞仪可提供精确的细胞计数，具有高重现性。为了确认NovoCyte流式细胞仪的细胞计数功能在推荐的Seahorse XF平板中接种T细胞的细胞密度范围内的性能，制备了T细胞悬液的梯度稀释液（从> 4 × 106个细胞/mL开始）。对每个测试的样品进行重复三次的细胞计数。此外，用死活染料7-AAD染色，以计数样品中的总细胞和活细胞。在XF测定过程中，需要两种计数来确定最佳接种密度和数据归一化。

如表1和图1所示，在高采样速度下计数时，使用NovoCyte流式细胞仪在分析范围内进行细胞计数具有高精度，CV<5%。在中速下也获得了类似的性能。与预期细胞数目相比，计数的准确性很高。

图1：使用安捷伦NovoCyte Quanteon流式细胞仪在两种不同的采集速度下，实际计数与预期数目的比较。表1显示了在不同采集速度下对同一细胞悬液进行三次测量所获得的%CV值

       Seahorse与NovoCyte进行XF测定的工作流如下：

 

根据XF T细胞代谢分析试剂盒用户指南使用T细胞进行XF测定的步骤示意图

安捷伦 NovoCyte 流式细胞仪提供了一种简单的解决方案，无需对流体系统进行复杂的校准或使用参比微球，并且样品之间的残留最少。NovoCyte使用小样品体积，提供总细胞和活细胞的准确细胞计数。该方法允许在接种前调整细胞密度，以防初始悬浮密度超出推荐范围。该工作流程还对最终悬浮液计数，该活细胞计数用于归一化接种板。此外，结合 NovoSampler Q，该系统以最少的手动操作时间提供了更高的通量，允许快速计数和制备多个样品，同时节省时间。

声明：仅供研究使用，不用于诊断性操作。

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